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熒光標(biāo)記二抗種類繁多,如何選擇?

一般來(lái)講,偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶(辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),熒光基團(tuán)(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn),對(duì)于Western Blot和ELISA,最常用的二抗是酶標(biāo)二抗;而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞免疫化學(xué),組織免疫化學(xué),流式細(xì)胞術(shù))中通常使用熒光標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào),可以使Biotin/Avidin檢測(cè)系統(tǒng)。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料,熒光染料種類很多,目前常用于熒光標(biāo)記二抗的主要以下幾種:

  • 異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)

FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4,最大吸收光波長(zhǎng)為490~495nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520~530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物,每一個(gè)抗體可標(biāo)記幾個(gè)FITC分子,IgM通常用小分子的熒光素標(biāo)記,如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感,通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC缺點(diǎn)是淬滅快,因此要和抗淬滅劑一起使用。

  • 四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC),Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)

這些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團(tuán)具有不同的吸收波長(zhǎng) (550, 570, 596nm)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(570, 590, 620nm)。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)時(shí),RRX尤其有用,可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用,因?yàn)镽RX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間,而且和這兩者覆蓋都很少氪氬燈激發(fā)光為488nm,598nm和647nm,分別Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激發(fā)波長(zhǎng)。因?yàn)镕ITC和PE可以被氬燈的488nm波長(zhǎng)激發(fā), 在流式細(xì)胞儀中用FITC作雙標(biāo),另一種用藻紅蛋白(PE)耦聯(lián)基團(tuán)要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物,呈紫紅色粉末,較穩(wěn)定,最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈現(xiàn)橙紅色熒光,與FITC的綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧R騎RITC熒光淬滅慢,也可用于單獨(dú)標(biāo)記染色。

  • 菁類染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)

Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)為492nm,發(fā)光波長(zhǎng)510nm的綠色可見(jiàn)光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定,要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑,因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng),在染色片儲(chǔ)存后會(huì)導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮,更穩(wěn)定,背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)光的最大波長(zhǎng)為550nm,最強(qiáng)發(fā)射光為570nm。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中,可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy3在氬光燈(514nm或528nm)下可以被激發(fā)出50%的光強(qiáng),在氦氖燈(543nm)或者汞燈546nm)下則約75%。Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。Cy5耦聯(lián)基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)最大650nm,發(fā)光波長(zhǎng)最大670nm。在氪氬燈(647nm)下它們可被激發(fā)出98%的熒光,在氦氖燈下(633nm)為63%。Cy5可以和很多其他的熒光基團(tuán)一起用在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中。由于它的最大發(fā)射波長(zhǎng)在670nm,Cy5很難用裸眼觀察,而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時(shí)采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡,在水相封片劑中應(yīng)當(dāng)加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時(shí),不推薦使用Cy5。

  • 藻紅蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin(PE)

存在于被稱為藻紅的多聚微粒中,位于葉綠素的反應(yīng)中心,在自然結(jié)構(gòu)中,藻紅蛋白吸收光能,吸收后轉(zhuǎn)化成能量,供其發(fā)育生長(zhǎng)。當(dāng)藻紅蛋白被分離和純化后,其蛋白質(zhì)變得具有很強(qiáng)的熒光,能吸收不同波長(zhǎng)的光,發(fā)出亮紅色的熒光,此時(shí)不再接受任何外來(lái)的光,也不能轉(zhuǎn)移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長(zhǎng)范圍較廣,最大的吸收波長(zhǎng)為566nm,最大的發(fā)射波長(zhǎng)為574nm。藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物具有以下優(yōu)點(diǎn):首先具有強(qiáng)的長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)和發(fā)射熒光,可避免來(lái)自其他生物材料熒光的干擾;并且具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率;另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學(xué)或合成材料的多位點(diǎn)穩(wěn)定交聯(lián)。

注:由于觀察熒光需要一定波長(zhǎng)的激發(fā)光,必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的儀器可發(fā)光的波段進(jìn)行選擇。另外注意多標(biāo)記中對(duì)探針色彩區(qū)分程度的要求例如,若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對(duì)靈敏度有更高的要求,則Cy3和Cy5就比其他的熒光團(tuán)探針要亮。

 

西美杰代理的全球知名二抗和底物生產(chǎn)廠商Seracare(KPL提供豐富的熒光標(biāo)記二抗,可檢測(cè)抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉(cāng)鼠、狗、牛,以及多種細(xì)菌類等物種;另外,還有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同類型抗體。小編下面匯總了部分常用熒光二抗:

 

 

FITC

TRITC

Cy3

Cy5

PE

抗人

5230-0425

-

5230-0355

5230-0370

-

抗小鼠

5230-0427

5230-0336

5230-0364

5230-0376

-

抗大鼠

5230-0301

-

5230-0361

-

-

抗豚鼠

5230-0303

-

-

-

-

抗兔

5230-0426

5230-0332

5230-0359

5230-0372

-

抗豬

5230-0297

-

-

-

-

抗山羊

5230-0294

-

5230-0358

5230-0371

-

抗鹿

5230-0329

-

-

-

-

抗火雞

5230-0327

-

-

-

-

抗雞

5230-0325

-

-

5230-0379

-

抗鴨

5230-0326

-

-

-

-

抗馬

5230-0320

-

-

-

-

抗貓

5230-0317

-

-

-

-

抗狗

5230-0314

-

-

-

-

抗牛

5230-0293

-

-

-

-

鏈和親霉素

5270-0028

-

5270-0022

5270-0023

5270-0021

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